【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬鏈球菌（2型）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Streptococcus suis serotype 2 Detecting Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25頭份/盒 & 50頭份/盒

【預(yù)期用途】

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcus suis）引起的一種人畜共患的傳染病。豬鏈球菌根據(jù)莢膜抗原可分為35個血清型，其中2型豬鏈球菌是重要的人畜共患病的病原，可感染人引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥及突發(fā)性死亡。該病多發(fā)于與生豬或豬肉產(chǎn)品接觸的從業(yè)人群。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，依據(jù)豬鏈球菌特有基因定性篩查檢測豬鏈球菌，對2型豬鏈球菌引起的相關(guān)病癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對2型豬鏈球菌基因設(shè)計一對特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含有2型豬鏈球菌DNA模板的情況下，利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為不含2型豬鏈球菌的其它菌的混合物，陽性對照為滅活的2型豬鏈球菌。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 如使用原始標本進行檢測，標本應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標本。

2. 如需在增菌后進行PCR檢測，則應(yīng)使用選擇性增菌液對原始標本進行增菌。

3. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4) 蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。或按以下方法操作：

a.取試劑準備區(qū)傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。

b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。

c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。

d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進一步使用培養(yǎng)法進行確診。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

1. 整個檢測過程應(yīng)嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

3. 為保證試劑不受標本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準備區(qū)。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記。

7. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。