深圳真瑞生物科技有限公司
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產(chǎn)品編號:CP006 檢測方法:熒光PCR 檢測樣品:口,鼻拭子 規(guī)格:25T/50T |
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:貓杯狀病毒檢測試劑盒(實(shí)時熒光PCR法)
英文名稱:Feline Calic Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于貓杯狀病毒檢測,不進(jìn)行病毒分型,可用于臨床貓杯狀病毒感染的輔助診斷,但不作確診使用。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對貓杯狀病毒基因組高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含貓杯狀病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T /盒 | 50T /盒 |
1 | FCV RT-PCR反應(yīng)液及酶混合液 | 20 μL×25管 | 20 μL×50管 |
2 | FCV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | FCV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注:陰性對照為貓基因組DNA,陽性對照為失去活性的貓杯狀病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.樣品取鼻拭子、口腔潰瘍面拭子、結(jié)膜拭子,采集方法如下:
(1) 鼻拭子:將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處,停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。將棉簽浸入2-4 ml采樣液中,尾部棄去。
(2) 口腔潰瘍面拭子:用棉簽擦拭舌、硬腭、腭中裂周圍,同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中,尾部棄去。
(3) 結(jié)膜拭子:用棉簽擦拭眼周圍分泌物,同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中,尾部棄去。
2.血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣品:取少量樣品(2~3克)于研缽或勻漿器中研磨,然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,3000rpm/min離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
a.計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù),從-20℃以下冰箱保存的試劑盒中取等量8聯(lián)PCR反應(yīng)管(內(nèi)裝有PCR反應(yīng)液),平衡至室溫;預(yù)留一管作為陰性對照一管作為陽性對照。
b.將實(shí)驗(yàn)所需的8聯(lián)PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
a.取出8聯(lián)PCR反應(yīng)管試劑,瞬時離心以去除管壁附著液體。
b.打開反應(yīng)管管蓋,在液封層上(切勿插入底部)加入5 μL處理好的樣本重懸液;陰性對照和陽性對照管則各加5 μL陰性對照或陽性對照品;
c.蓋好PCR反應(yīng)管蓋,瞬時離心以去除管壁附著液體。
d.記錄模板加樣順序。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行PCR檢測。
4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道FCV熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 42℃:10分鐘(min) | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 5 | |
55℃:40秒(s) | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結(jié)束時采集熒光信號) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
+ | 標(biāo)本中檢出FCV病毒RNA |
- | 標(biāo)本中未檢出FCV病毒RNA |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項(xiàng)】
1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,不能混用;實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放。
6. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。
9. 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。