【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：貓皰疹病毒I型檢測試劑盒（實(shí)時熒光PCR法）

英文名稱：Feline Herpesvirus I Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

貓皰疹病毒I型?。?/span>Feline Herpesvirus I,FHV-1）,又叫貓鼻氣管炎病毒是由貓皰疹病毒I型（FHV-1）引起的貓呼吸道感染等疾病。本試劑盒利用實(shí)時熒光PCR原理，主要用于貓皰疹病毒I型的定性篩查檢測及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對貓皰疹病毒I型基因設(shè)計(jì)特異性引物和分子信標(biāo)探針，在待檢樣本中含有貓皰疹病毒I型DNA的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)熒光信號進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為不含貓皰疹病毒I型的其它菌的混合物，陽性對照為滅活的貓皰疹病毒I型。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 采集貓的咽喉拭子、眼睛、鼻分泌物或潰瘍傷口等作為樣本，咽喉拭子用少量生理鹽水浸潤后取上清待檢；其他樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000 g離心15 min，收集上清待檢

2. 如需在增菌后進(jìn)行PCR檢測，則應(yīng)使用選擇性增菌液對原始標(biāo)本進(jìn)行增菌。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

a.計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)，從-20℃以下冰箱保存的試劑盒中取等量8聯(lián)PCR反應(yīng)管（內(nèi)裝有PCR反應(yīng)液及混合酶液）,平衡至室溫；預(yù)留一管作為陰性對照一管作為陽性對照。

b.將實(shí)驗(yàn)所需的8聯(lián)PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作?；虬匆韵路椒ú僮鳎?/span>

a.取試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。

b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。

c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。

d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測。

3.加樣

a.取出8聯(lián)PCR反應(yīng)管試劑，瞬時離心以去除管壁附著液體。

b.打開反應(yīng)管管蓋，在液封層上（切勿插入底部）加入5 μL處理好的樣本重懸液；陰性對照和陽性對照管則各加5 μL陰性對照或陽性對照品；

c.蓋好PCR反應(yīng)管蓋，瞬時離心以去除管壁附著液體。

d.記錄模板加樣順序。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行PCR檢測。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

3. 為保證試劑不受標(biāo)本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。