非洲豬瘟病毒微流控熒光PCR快速檢測試劑盒

LabChip Ultra Fast Fluorescence PCR Detection Kit for African Swine Fever Virus

【預期用途】

非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，臨床上以高熱、網狀內皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達100%。我國將其列為一類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，并且列入《禁止生物武器公約》核查動物病原體清單。

本試劑盒用于對樣品中的非洲豬瘟 DNA 進行快速定性檢測，可用于該病毒感染的實驗室診斷和現(xiàn)場檢測。檢測結果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)。實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業(yè)培訓，具備相關的實驗操作資格。

【檢測原理】

本試劑盒利用實時熒光PCR技術，以非洲豬瘟病毒基因組的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設計特異性引物及探針，探針標記FAM熒光素，配以Taq DNA 聚合酶等成分，使用配套的極速熒光PCR設備進行 PCR擴增，從而對樣品中非洲豬瘟病毒DNA 進行快速定性檢測。

【主要組成成份】

注：不同批號試劑盒的成份不可以互換使用。

【包裝規(guī)格】

40頭份/盒

【儲存條件及有效期】

試劑于-20℃儲存；反復凍融不超過 5 次；有效期12個月。

【適用儀器】

ZR-LC16/ V280 / UF-150型微流控極速熒光定量PCR儀。

【樣品要求】

1.適用標本類型：血液、組織、血粉、飼料等。

2.標本采集與處理

（1）血液樣品：用EDTA抗凝采血管采集血液，充分混勻，編號備用。

（2）組織樣品：用無菌剪刀和鑷子剪取病死或剖殺豬主要臟器（淋巴結、脾臟、扁桃體）約2g，加入10倍體積PBS或生理鹽水，于研缽或組織勻漿器中充分研磨后轉入1.5 mL離心管中編號備用。

（3）血粉：同上處理，只不過省掉研磨步驟。

（4）飼料等其它樣品：參照專用的商品化提取試劑盒的說明書操作。

3.樣本的儲存

樣品可立即用于檢測，如不能立即檢測，在 4℃保存不超過 24 小時，-20℃保存不超過3個月，-70℃可長期保存，反復凍融不超過 5 次。

【檢測方法】

一、病毒DNA的提取

（1）待檢樣品份數(shù)總和用n表示 ，取n個滅菌的離心管，逐管編號。

（2）每管加入處理液A 30μl。

（3）每管分別加入已處理的待檢樣品3μl，充分混勻，18-25℃處理5分鐘，旋渦震蕩30秒。

（4）每管加入處理液B 30μl，震蕩混勻，待檢。

（5）處理后的樣本如在2小時內進行下一步試驗，請于4℃保存，如不能立即進行下一步試驗，請于-20℃保存。

備注：飼料等其它樣品，此步驟同樣參照專用的商品化提取試劑盒的說明書操作。

二、PCR試劑配置（在試劑準備區(qū)進行）及加樣（在樣品處理區(qū)進行）。

1. 在試劑準備區(qū)，按下列組成配制PCR 混合液（n為待測樣本數(shù)+1陽性對照+1陰性對照）：

（注意：使用前確保PCR反應液和DNA聚合酶充分融化）

2. 將PCR混合液按7μl/管 分裝至PCR反應管中，并移至樣品處理區(qū)。

3. 用帶濾芯的吸嘴分別取已處理好的樣品、陰性對照、陽性對照各3μl分別加到裝有 PCR混合液的反應管中漩渦混勻、瞬時離心。

4. 使用UF-150型號的儀器，各取 10μl 加入PCR 擴增芯片中，蓋上芯片膜，移至擴增檢測區(qū)。

使用V280、ZR-LC16型號的儀器，各取 8μl 加入PCR 擴增芯片中，蓋上芯片蓋，移至擴增檢測區(qū)。

三、PCR擴增檢測（在擴增檢測區(qū)進行）

1. 將PCR 芯片插入微流控極速熒光定量PCR儀中進行擴增檢測。

2. 循環(huán)參數(shù)設定：

3. 儀器檢測通道選擇：熒光信號選擇FAM 通道。

四、質控標準

1. 陰性對照：結果為陰性。

2. 陽性對照：結果為陽性，陽性對照 Ct 值≤33。

3. 以上兩項需在一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，實驗應重新進行。

五、結果分析

1. 實驗結束后，根據(jù)相關儀器的軟件進行分析，調節(jié)噪聲容限至基線噪聲以上，使陰性對照 Ct 值不出現(xiàn)任何數(shù)值。

2. 閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點為準。

3. 記錄儀器自動分析計算出的樣品 Ct 值。

【臨界值】本試劑盒的臨界值為Ct值= 38。

【檢測結果的解釋】

1. 每次實驗均需將試劑盒內的陰性對照、陽性對照與待檢樣品一同檢測，檢測結果應符合其性能指標，否則本次實驗無效。

2. 實驗結果判斷方法

2.1陰性結果判定：如果樣品在 FAM 通道擴增曲線均不呈 S 型、Ct 值為 UNDET 或者＞38.00。

2.2.陽性結果判定：如果樣品在 FAM 通道擴增曲線呈S 型且Ct 值≤38，則結果為陽性。

3. 在質控正常的前提下，實驗結果判讀模式

3.1陽性樣品報告格式為：樣品檢測到非洲豬瘟病毒DNA，濃度高于試劑盒的檢測限；

3.2陰性樣品報告格式為：樣品未檢測到非洲豬瘟病毒DNA，濃度低于試劑盒的檢測限。